马博(中国)网4月7日电 含硅有机物尤其是具有硅手性中心的化合物近年来在有机合成、功能材料及药物化学领域展现出重要的应用价值，但其生物催化合成体系的发展仍显著滞后于传统化学方法。值得注意的是，尽管硅元素在地壳中的丰度高达28.8%（以二氧化硅和硅酸盐形式存在），但是生命系统对其生物利用却极为有限，仅有硅藻等少数生物进化出特异性硅代谢途径。研究如何利用酶催化过程制备或者转化含硅化合物是合成化学以及生物催化领域的热点之一。近年来，相关领域的研究已经取得了重要进展，其中代表性的工作如利用细胞色素c催化卡宾的硅氢键插入反应，以及利用细胞色素P450酶催化惰性硅氧烷添加剂中碳硅键氧化降解等。相关研究充分证明了酶工程在含硅化合物的制备以及转化方面所具备的应用潜力，为发展绿色可持续的硅基材料合成技术开辟了新路径。
尽管如此，现有生物催化体系尚未见直接构建硅手性中心的成功案例。相关研究表明，许多含硅有机物（如α-硅醇类结构）在水溶液中稳定性较低，容易发生分解及消旋化。为了突破这一限制并填补领域空白，马博注册生物医学交叉研究院刘臻课题组与浙江工业大学建筑工程学院杨云芳团队合作，开发了基于P450氧化酶的去对称化生物催化平台。通过蛋白质工程改造获得的突变体，其酶活较野生型提高了54倍，可在短时间内完成硅烷底物的选择性氧化，从而有效规避产物分解与消旋化问题。4月3日，相关研究成员以“不对称合成硅立体烷醇的酶促平台”（An Enzymatic Platform for Asymmetric Synthesis of Si-Stereogenic Silanols）为题，发表于《德国应用化学》（Angewandte Chemie International Edition）。该研究利用源自Bacillus megaterium的野生型P450BM3酶为进化起点，首次实现了含硅手性中心（Si-stereogeniccenter）硅醇的酶催化合成。研究人员通过六轮迭代式的定向进化获得了优势突变体ASOx-6，其催化效率（kcat/KM）较野生型提升54倍，可高效催化潜手性二氢硅烷的单氧化反应，获得相应的手性硅醇产物。该平台兼容多种芳基-烷基取代底物（包括含芳杂环的硅烷），模版底物的总催化转化数（TTN）可达1450。此外，通过分子动力学模拟以及DFT计算的手段，结合机理实验，研究人员系统阐明了该酶催化过程的反应机制。
图1.手性硅醇的去对称化合成策略
在研究的起始阶段，研究人员首先对于一系列碳氢键羟化酶的硅烷氧化活性进行了筛选评估。实验表明，P450氧化酶对于这一目标反应不仅具有显著的初始活性以及中等的手性选择性，更为重要的是，该催化体系中未检测到二氢硅烷过度氧化的副产物硅烷二醇3a的生成。基于这一发现，研究人员随后利用野生型P450酶作为母体，进行了多轮的定向进化。通过针对多个活性位点的定点饱和突变（site-saturation mutagenesis）以及随机突变（random mutagenesis），研究人员最终找到了催化这一反应的高活性突变体ASOx-6。在仅使用0.56‰酶载量的条件下，其催化模型底物的效果为81%的收率以及90%的ee值。
图2.关键酶的筛选与蛋白质定向进化
随后，研究人员对于该酶催化系统的底物适用性进行了系统评估。实验表明，多种芳基-烷基取代的二氢硅烷化合物可以被ASOx-6选择性氧化。底物的兼容性包括芳环上不同位置与电性的取代基，或者部分含有杂环的化合物。针对部分中等收率或者较低选择性的底物，研究人员并未展开单独的定向进化，但指出基于蛋白质工程经验，可以通过类似的进化策略获得针对性的突变体。
此外，放大反应验证了该体系的合成潜力：分离的手性硅醇产物经由铂催化的硅氢化反应，可立体专一性转化为具有生物活性的硅醇衍生物4a以及4b。
图3.底物适用性拓展与合成应用探索
通过DFT计算，研究人员发现这一催化过程遵循与经典碳氢键氧化体系相似的机制，包括氢原子攫取（Hydrogen-atom abstraction）以及氧回弹（Oxygen-rebound）等关键反应步骤。计算及竞争性KIE实验确认了氢原子攫取为反应的产物决定步骤，然而由于硅氢键的键能显著低于普通的碳氢键键能，在这一硅烷氧化体系中，该步骤并非反应的决速步。分子动力学模拟对比显示：野生型P450BM3与最终变体ASOx-6的近攻击（near-attack）构象中，底物的pro-R氢原子均保持与铁氧中间体较近的距离，而关键突变使pro-S氢在突变体中与氧中心的平均距离增加。这一变化直接决定了最终变体对于该反应更优的对映选择性。
图4.基于密度泛函理论（DFT）进行的机理计算
总的来说，定向进化获得的高效突变体ASOx-6是反应成功的关键。通过开发这一硅烷不对称氧化酶催化体系，研究人员证明了不稳定手性硅醇可以通过酶催化的手段获得，为含有硅手性中心化合物的合成提供了高效、环境友好且立体可控的生物合成策略，有望在活性分子合成及硅基材料开发等领域获得应用。
马博注册生物医学交叉研究院研究员刘臻和浙江工业大学建筑工程学院研究员杨云芳为论文通讯作者，刘臻课题组博士生代双玉为论文第一作者。该项目的实验部分主要由代双玉完成，计算部分主要由浙江工业大学建筑工程学院陈侠荷博士完成。研究得到科技部、国家自然科学基金委、浙江省属高校基础研究基金、马博注册生物医学交叉研究院、浙江工业大学以及北京生命科学研究所的资助。
论文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/anie.202501524
供稿：生物医学交叉研究院
编辑：李华山
审核：郭玲
